維甲酸與基因表達

 

全反式維甲酸(RA, ATRA)是一種多效激活因子，負責調節與正常脊椎動物細胞分化、細胞增殖、凋亡和胚胎發育等過程相關的基因。維甲酸及其作為激活配體的受體蛋白是眾多分析維甲酸介導基因表達的研究熱點。目前的技術，包括siRNA敲除特定基因，RT-PCR評估基因表達，染色質免疫沉淀，已經成為擴展經典RA信號通路認知的關鍵。 
 

維生素A (全-反式-維甲酸)及其酯是功能性RA的前體，而胡蘿卜素，特別是β-胡蘿卜素，是由植物合成的維生素A前體（詳見圖 1、2、3）。類維生素A這一術語既包括結構上與維生素A有關的化合物，也包括具有生物維生素A活性的化合物。動物通過代謝飲食中的胡蘿卜素生成脂溶性類維生素A，并將類維生素A主要儲存在肝臟中；動物不能通過其他機制合成類維生素A。胡蘿卜素存在于幾種食用植物中，包括黃色、紅色或深綠色的蔬菜，以及紅色或黃色的非柑橘類水果。人類主要的動物性維生素A飲食來源包括肝臟、魚類和魚油，如金槍魚、沙丁魚和鱈魚的魚油。在美國，乳制品通常補充維生素A和維生素D。維生素A攝入后與視黃醇結合蛋白(RBP)結合，用于血漿運輸和細胞攝取。β-胡蘿卜素和維生素A酯成為乳糜微粒殘留物的伴侶后，經轉運被細胞表面受體吸收。1

 

 

細胞內維生素A水平由細胞視黃醇結合蛋白(CRBPs)和細胞視黃酸結合蛋白(CRABP-I和CRABP-II)維持。2CRBP與視黃酸酯的儲存和運輸有關，而CRABP則是視黃酸的伴侶。活性類維生素A的內源性濃度是至關重要的，并處于嚴密的體內平衡控制下，因為類維生素A水平過高或缺乏均可致畸。2 

 

β-胡蘿卜素通過酶促氧化裂解β-胡蘿卜素15,15 '-單氧化酶(EC 1.14.99.36)，從而形成視黃醛的兩個分子。3,4 β-胡蘿卜素15,15 '-單氧化酶的基因已經確認與各種各樣的物種有相當數量的同源性，包括人類、小鼠、雞、斑馬魚、果蠅、和藍藻魚腥藻和聚球藻種。

 

維生素A及其酯通過兩步氧化過程轉化為維甲酸及相關化合物。視黃醇在視黃醇脫氫酶(EC 1.1.1.105)或其他醇脫氫酶的作用下被氧化成視黃醛。視黃醛隨后被視黃醛脫氫酶(EC.1.2.1.36)氧化成RA。2 細胞維甲酸結合蛋白I (CRBP-I)作為維甲酸和視黃醛的伴侶，通過氧化酶促進其代謝。

 

類維生素A核受體蛋白

視黃酸受體(RAR)和視黃酸X受體(RXR)是參與視黃酸介導轉錄的兩個核受體蛋白家族。5 這些受體蛋白是類固醇/甲狀腺/維甲酸核受體核轉錄家族的成員。這些核受體結合在一起，能夠轉錄和調節數百個基因。RAR和RXR各有三個同位型，分別為α、β和γ。盡管每個RAR同位型的基因序列與另外兩個同位型有很大的差異，但每個同位型的基因序列在人和小鼠之間高度保守，因此推測每個RAR同位型具有其特定的功能。6除了這三種同位型外，RAR和RXR都被發現作為多種同位型存在，這些同位型是由一個主要轉錄本的選擇性剪接或啟動子使用差異造成的。7

RAR和RXR受體蛋白的單體形式無活性。RAR自身不形成同源二聚體，而是與RXR形成異源二聚蛋白(RAR:RXR)。該RAR:RXR蛋白復合物是維甲酸信號的主要受體復合物。除了與RAR形成異源二聚體外，RXR還能與包括PPAR在內的其他受體蛋白進行二聚化。5 

 

RAR:RXR蛋白復合物與維甲酸反應成分(RREs)或類維甲酸X反應成分(RXREs)結合，每個反應成分都是成分明確的DNA序列。7 RXR增強了RAR蛋白與RARE序列的結合。5在配體受體結合位點缺乏配體的情況下，apo-RAR:RXR異源二聚體會集合干擾轉錄過程的輔抑制物、蛋白質和酶。8核受體輔抑制物(NCoR)和視黃酮和甲狀腺激素受體(SMRT)的沉默介質通過結合RAR和RXR的配體結合域抑制轉錄。隨后結合含有組蛋白去乙酰化酶活性(HDACs)的蛋白復合物，這些酶在核小體內對組蛋白去乙酰化。乙酰基的去除增加了組蛋白尾部的正電荷，從而增加了組蛋白對帶負電荷的染色質的吸引力。結果是染色質變得更加緊密，限制了轉錄因子附著在基因起始位點的能力，限制或阻止了轉錄 (見 圖4）。9 

 

 

RA和9-順-維甲酸 (9-反-RA)與RAR的配體受體結合位點有很強的親和力。9-順RA對RXR的配體結合位點有很強的親和力,但RA不是RXR的配體。盡管9-順RA在體外表現出對RXR的特異性，但是并沒有證據表明9-順RA是體內RXR活化的實際配體。1

如果配體附著在RXR的配體結合區域，其構象的改變不足以克服輔抑制物的集合。該無法激活RXR以啟動受體通路現象被稱為RXR從屬或apo-RAR沉默。5,10或者，當RA或另一種類視黃素結合至RAR配基的配體結合區域時，蛋白質構象的變化足以使募集到的輔抑制復合物轉化為輔活化物。如果RAR和RXR的結合域都有配體，則蛋白復合物的折疊性增強。RA通過CRABP-II從細胞質轉移到細胞核，CRABP-II將RA作為伴侶蛋白轉運至RAR:RXR異源二聚體的RAR域的配體受體結合位點。11 

 

維甲酸介導的基因轉錄經典途徑

RA調控基因表達的經典途徑有四個特定的步驟，盡管這些步驟的順序并不是對所有基因都相同。7,8 RA介導的轉錄被定義為12：

• RA或其他類維生素A配體與配體結合位點的結合

• 受體二聚化(RAR:RXR二聚化)

• 受體異源二聚體與DNA (RAREs)結合

• 通過染色質重構和轉錄機制的募集，對基因進行轉錄調控

DNA結合直接受修飾核小體染色質結構并使轉錄機制進入基因啟動子區域的輔激活物和輔抑制物的作用影響。

 

一旦類維生素A的結合修飾了RAR:RXR復合物，輔抑制物即與復合物分離，并募集輔激活物。轉錄機制復合體必須進行染色質重構后才能獲得待轉錄的基因。類固醇受體輔激活物(SRC)蛋白和具有組蛋白乙酰轉移酶(HAT)活性的p160蛋白可以在配體存在的情況下附著于RAR或RXR的配體結合域。SRC輔激活物則乙酰化DNA結合位點附近的核心組蛋白中的賴氨酸殘基，中和組蛋白電荷并減弱與染色質的相互作用。染色質變得松散，變得更容易參加DNA轉錄機。9 

 

ATP依賴的染色質重構蛋白（如SWI/SNF）利用ATP水解的能量重新定位核小體結合到基因啟動子區域，形成無核小體或核小體間隔區域，為轉錄機提供通路。額外的輔激活或輔整合蛋白的一個例子是p300/CRB蛋白。p300/CRB通過募集額外的通用轉錄因子至啟動子區域，并與轉錄起始位點的轉錄機結合，在類維甲酸通路中發揮作用。(見 圖5)。7,8

 

 

染色質重構后，輔活化子游離出來，可能會被蛋白酶體降解。包含復合物(SMCC)的SRB和中介隨后被類維生素A受體所吸收。介質復合物促進轉錄機制，包括RNA聚合酶II (Pol II)、基因轉錄中的關鍵酶，進入基因啟動子的起始位點。染色質重構也促進了其他轉錄因子的結合。RA啟動了TNF-α-誘導的與NF-κB的結合，并與TNF-α協同作用去招募并刺激與酶活性相關的Pol II的磷酸化，(見 圖6)。13 

 

基因轉錄調控

RA影響的生理過程的多樣性可能部分歸因于RAR和RXR受體家族中可能存在的組合和冗余。盡管RARs是啟動類視網膜通路的主要因素，而RXRs除了介導RARE被RARs附著外，還可能對這一過程起協同作用。5 在一項定性研究中，Balmer和Blomhoff回顧了發表的532個由RA調控的基因的數據。他們對文獻的分析包括評估哪些基因強有力的證據證明其被經典通路所調控。12只有27個基因被強烈認為受經典通路調控，其中26個基因上調，一個基因被可變調控。不考慮通路，RA上調的基因數量為311個；有趣的是，212個基因要么下調，要么被可變調控。直接的、經典的途徑雖然提供了RA功能一些視角，但并不是RA受影響表達的唯一的方法。

 

RA通路的綜述通常包括泛素化和磷酸化作為下游過程，對基因調控和轉錄至關重要。1,7,8泛素化終止類維生素A的信號通路后，RAR/RXR被蛋白酶體降解，因此泛素化可能通過啟動終止過程介導轉錄。磷酸化是非常重要的，因為RAR和RXR亞型可以作為激酶底物發揮作用。磷酸化可能參與蛋白體降解，影響全RAR:RXR復合物與共調節因子和通用轉錄因子的結合能力。8 磷酸化的絲氨酸殘基RARγ已經被證明能夠控制RARγ的反式激活和由蛋白酶體對RARγ的降解。7

 

介質蛋白的表達可能為間接調控轉錄提供了一種解釋機制。RA可能通過調控其他轉錄因子而不依賴與RAREs的結合來調控基因表達。1 這種間接調控可以解釋干擾蛋白的調控和表達導致的目標基因下調。

 

RIP140是一種輔助抑制蛋白，優先與配體附著的RAR結合，而不是與通常招募輔助抑制蛋白的apo-RAR:RXR復合物結合。RIP140抑制多個配體結合核受體的反式激活功能，并將HDACs招募到RAR:RXR結合的基因啟動子。RIP140可將HDAC招募到其他蛋白中作為底物使用，或者也可自身作為HDAC的底物發揮作用。RIP140這種輔抑制物的選擇性結合被推測為類維生素A信號通路提供一種調節基質。10,14 最近使用經RIP140 siRNA處理的NT2/D1細胞開展的研究發現，依賴于RA的基因表達水平出現了顯著的變化，而不是不依賴于RA的基因。15 

 

除了RAR和RXR受體家族外，RA還作為過氧化物酶體增殖物激活受體PPARβ/δ的配體，以及誘導細胞生存基因的核受體。11 脂肪酸結合蛋白5(FABP5)作為轉移RA至PPARβ/δ受體的一個伴侶蛋白。RA在核內RAR和PPARβ/δ的分配分別由轉移蛋白CRABP-II和FABP5調控，并且FABP5表達增加會使RA向PPARβ/δ的轉移增加。21,23 相對于CRABP-II伴侶蛋白的表達濃度，表達高濃度脂肪酸結合蛋白5 (FABP5)伴侶蛋白的MCF-7細胞，與細胞存活和增殖相關。11 除了核基因轉錄外，RA還被證明可以介導線粒體基因的轉錄；雖然這一機制還未明確，但已經確立了包括直接和間接的表達途徑的理論。16 

 

由于RXR能夠與包括其他PPAR在內的其他核受體形成異源二聚體，因此它可以與PPAR介導的其他信號通路發生交聯。7,8 9-順RA可以作為PPAR:RXR的單一激活配體，9-順RA和其他維甲酸(RXR的特異性配體化合物)可以通過激活PPAR:RXR二聚體，不依賴于PPAR配體而啟動PPAR信號通路。7,8 此外，非維生素A原類胡蘿卜素可能會與PPAR受體相互作用，因為PPAR可以被各種親脂分子激活。17 維甲酸已表現出靶向P13K/Akt通路，早期Akt活性增加，但后期Akt活性降低。18 維甲酸影響的其他替代機制可能仍有待發現。

 

由于有大量基因受RA信號影響，因此內源性維甲酸水平對正常發育至關重要。極端濃度水平對分化細胞是致畸的，規定的濃度范圍是正常胚胎發育所必需的。合成的類維生素A、類維生素A和維甲酸的代謝阻斷劑(RAMBAs)目前正在研究其作為RAR/RXR配體修飾信號，通過細胞色素P450酶(CYPs)阻斷RA代謝，以及提高內源性RA水平這幾方面的潛在價值。19,20

 

參考文獻

1.Blomhoff R, Blomhoff HK. 2006. Overview of retinoid metabolism and function. J. J.. 66(7):606-630. http://dx.doi.org/10.1002/neu.20242

2.McCaffery PJ, Adams J, Maden M, Rosa-Molinar E. 2003. Too much of a good thing: retinoic acid as an endogenous regulator of neural differentiation and exogenous teratogen. Eur J Neurosci. 18(3):457-472. http://dx.doi.org/10.1046/j.1460-9568.2003.02765.x

3.Wyss A. 2004. Carotene Oxygenases: A New Family of Double Bond Cleavage Enzymes. 134(1):246S-250S. http://dx.doi.org/10.1093/jn/134.1.246s

4.Lakshman MR. 2004. Alpha and Omega of Carotenoid Cleavage. 134(1):241S-245S. http://dx.doi.org/10.1093/jn/134.1.241s

5.Chambon P. 2005. The Nuclear Receptor Superfamily: A Personal Retrospect on the First Two Decades. 19(6):1418-1428. http://dx.doi.org/10.1210/me.2005-0125

6.Krust A, Kastner P, Petkovich M, Zelent A, Chambon P. 1989. A third human retinoic acid receptor, hRAR-gamma.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 86(14):5310-5314. http://dx.doi.org/10.1073/pnas.86.14.5310

7.Bastien J, Rochette-Egly C. 2004. Nuclear retinoid receptors and the transcription of retinoid-target genes. Gene. 3281-16. http://dx.doi.org/10.1016/j.gene.2003.12.005

8.McGrane MM. 2007. Vitamin A regulation of gene expression: molecular mechanism of a prototype gene. The Journal of Nutritional Biochemistry. 18(8):497-508. http://dx.doi.org/10.1016/j.jnutbio.2006.10.006

9.KISHIMOTO M, FUJIKI R, TAKEZAWA S, SASAKI Y, NAKAMURA T, YAMAOKA K, KITAGAWA H, KATO S. 2006. Nuclear Receptor Mediated Gene Regulation through Chromatin Remodeling and Histone Modifications. Endocr J. 53(2):157-172. http://dx.doi.org/10.1507/endocrj.53.157

10.Wei L. 2004. Retinoids and Receptor Interacting Protein 140 (RIP140) in Gene Regulation. CMC. 11(12):1527-1532. http://dx.doi.org/10.2174/0929867043365017

11.Schug TT, Berry DC, Shaw NS, Travis SN, Noy N. 2007. Opposing Effects of Retinoic Acid on Cell Growth Result from Alternate Activation of Two Different Nuclear Receptors. Cell. 129(4):723-733. http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2007.02.050

12.Balmer JE, Blomhoff R. 2002. Gene expression regulation by retinoic acid. J. Lipid Res.. 43(11):1773-1808. http://dx.doi.org/10.1194/jlr.r100015-jlr200

13.Witcher M, Pettersson F, Dupere-Richer D, Padovani A, Summers-Deluca L, Baldwin AS, Miller WH. Retinoic acid modulates chromatin to potentiate tumor necrosis factor alpha signaling on the DIF2 promoter. Nucleic Acids Research. 36(2):435-443. http://dx.doi.org/10.1093/nar/gkm1058

14.White KA, Yore MM, Warburton SL, Vaseva AV, Rieder E, Freemantle SJ, Spinella MJ. 2003. Negative Feedback at the Level of Nuclear Receptor Coregulation. J. Biol. Chem.. 278(45):43889-43892. http://dx.doi.org/10.1074/jbc.c300374200

15.Heim KC, White KA, Deng D, Tomlinson CR, Moore JH, Freemantle SJ, Spinella MJ. 2007. Selective repression of retinoic acid target genes by RIP140 during induced tumor cell differentiation of pluripotent human embryonal carcinoma cells. Mol Cancer. 6(1):57. http://dx.doi.org/10.1186/1476-4598-6-57

16.Berdanier CD. 2006. Mitochondrial Gene Expression: Influence of Nutrients and Hormones. Exp Biol Med (Maywood). 231(10):1593-1601. http://dx.doi.org/10.1177/153537020623101003

17.Bertram JS, Vine AL. 2005. Cancer prevention by retinoids and carotenoids: Independent action on a common target. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1740(2):170-178. http://dx.doi.org/10.1016/j.bbadis.2005.01.003

18.Bastien J, Plassat J, Payrastre B, Rochette-Egly C. 2006. The phosphoinositide 3-kinase/Akt pathway is essential for the retinoic acid-induced differentiation of F9 cells. Oncogene. 25(14):2040-2047. http://dx.doi.org/10.1038/sj.onc.1209241

19.Lippman SM, Lotan R. 2000. Advances in the Development of Retinoids as Chemopreventive Agents. 130(2):479S-482S. http://dx.doi.org/10.1093/jn/130.2.479s

20.Njar VC, Gediya L, Purushottamachar P, Chopra P, Vasaitis TS, Khandelwal A, Mehta J, Huynh C, Belosay A, Patel J. 2006. Retinoic acid metabolism blocking agents (RAMBAs) for treatment of cancer and dermatological diseases. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 14(13):4323-4340. http://dx.doi.org/10.1016/j.bmc.2006.02.041

21.Wolf G. Retinoic acid as cause of cell proliferation or cell growth inhibition depending on activation of one of two different nuclear receptors. 66(1):55-59. http://dx.doi.org/10.1111/j.1753-4887.2007.00006.x

22.Perissi V, Rosenfeld MG. 2005. Controlling nuclear receptors: the circular logic of cofactor cycles. Nat Rev Mol Cell Biol. 6(7):542-554. http://dx.doi.org/10.1038/nrm1680

23.Schug TT, Berry DC, Toshkov IA, Cheng L, Nikitin AY, Noy N. 2008. Overcoming retinoic acid-resistance of mammary carcinomas by diverting retinoic acid from PPAR / to RAR. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105(21):7546-7551. http://dx.doi.org/10.1073/pnas.0709981105